ADN RECOMBINANTE 

Titulo: “A ligation and restriction enzyme independent cloning technique: an alternative to conventional methods for cloning hard‑to‑clone gene segments in the influenza reverse genetics system”

Objetivo: Desarrollar una técnica de clonación direccional sin usar enzimas de restricción ni ligasa aplicable al sistema de genética inversa de influenza, mejorando la eficiencia en genes con sitios internos de restricción

Gen o secuencia a clonar: Segmentos policásicos del virus influenza A: PB2 y PB1, específicamente de cepas H9N2 y H5N6.

Enzima de restricción: Ninguna: la técnica evita el uso de enzimas de restricción mediante creación de “megaprimer” PCR con extremos homólogos.

Enzima ligasa: Ausente: no se utiliza ligasa, se confía en uso de fragmentos linealizados y reparación en células después de digestión con DpnI

Vector: Plásmido pHW2000, con promotrores RNA Pol I/Pol II, comúnmente usado en sistemas de genética inversa de influenza.

Célula receptora: Células HEK‑293T utilizadas para transfección de los plásmidos recombinantes y generación in vitro del virus.

Mecanismo de transferencia: Se genera un “megaprimer” por PCR con overhangs complementarios al vector, luego se anella durante termociclado para introducirlo en el plásmido; posterior digestión de ADN parental con DpnI y transformación de HEK‑293T.

Métodos de identificación de clones: Verificación mediante secuenciación Sanger y selección funcional por generación de virus recombinantes en células HEK‑293T.

Imagen obtenida de ADN RECOMBINANTE

Evidencia bibliográfica

1. Bhat S, Bialy D, Sealy JE, Sadeyen J-R, Chang P, Iqbal M. A ligation and restriction enzyme independent cloning technique: an alternative to conventional methods for cloning hard-to-clone gene segments in the influenza reverse genetics system. Virol J [Internet]. 2020;17(1):82. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1186/s12985-020-01358-2

ACIDOS NUCLÉICOS RECOMBINANTES

Emergence of SARS‑CoV‑2 through recombination and strong purifying selection (2020)

El estudio analiza el origen de la región de unión al receptor (RBM) del SARS‑CoV‑2. Evidencia que todo el RBM fue adquirido por recombinación natural con coronavirus de pangolines. Esto ocurrió de forma espontánea en la naturaleza, no en laboratorio. La recombinación facilitó la transmisión entre especies (murciélagos → pangolines → humanos). Además, se identificó una fuerte selección purificadora que conserva la funcionalidad viral. Concluye que estos procesos combinados permitieron la aparición y adaptación óptima del SARS‑CoV‑2

Imagen obtenida de SARS cov2

Referencia bibliográfica 

1. Wang H, Cui X, Cai X, An T. Recombination in positive-strand RNA viruses. Front Microbiol [Internet]. 2022;13:870759. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2022.870759